미생물을 이용한 생리활성물질 분리

활성 물질의 분리, 정제 방법은 분리를 원하는 활성 물질의 물리 화학적 성질에 따라 달라져야 합니다. 여러 가지 서로 다른 원리에 근거하는 분리, 정제 방법 중에서 적절한 방법을 효과적으로 조합하여야 합니다. 일반적으로 동일한 원리에 근거한 방법으로는 성공적으로 활성 물질을 분리, 정제하기 어렵습니다. 왜냐하면 동일한 원리에 근거한 분리, 정제 방법은 여러 번 반복하여 사용하더라도 물질의 분리도 어느 정도 높일 수 있으나 완전한 분리는 어렵기 때문입니다.

또한 천연물로부터 항생 물질 탐색 연구분야의 물질 분리, 정제 방법은 유기화학 또는 천연물 연구 분야에서 행하는 방법과는 상당한 차이가 있을 수 있습니다. 즉 유기 화학 등의 분야에서는 이미 예상하고 있는 구조를 가진 화합물을 몇 가지 다른 화합물과 섞여 있는 혼합물 중에서 분리하는 것이고, 천연물 연구분야에 있어서는 어떤 골격구조를 지닌 화합물, 즉 특정 그룹의 화합물을 추적해 나가는 것이 일반적입니다. 그러나 생리 활성물질의 탐색 연구분야에서는 목적으로 하는 생리활성 물질 이외에 화학적으로는 전혀 모르는 수백 종의 화합물을 포함하는 미생물 대사산물 가운데서 생리활성을 지표로 하여 찾아 나가야 합니다. 따라서 목표로 하는 화합물의 물리 화학적 특성과 생물활성을 타나 내는 분획과의 빠르고 간단한 연결방법이 중요합니다.

 

따라서, 구조해석, 임상실험 등에 사용할 시료확보를 위한 본격적인 물질 분리, 정제를 행하기 이전인 활성물질 탐색의 초기 단계에서 목적으로 하는 활성물질의 신규성 또는 유용성을 미리 확인할 필요가 있습니다. 이를 위해 먼저 미생물 배양액으로부터 각종 생리활성을 검정한 후에 일반적으로 몇 가지 유기용매에 대한 이행성, 활성탄 및 이온 교환 수지에 대한 흡탈착 성, pH와 열에 대한 안정성 등의 예비실험을 행합니다. 일반적으로 이 시점에서 목적으로 하는 활성물질이 어떤 그룹에 속하는 물질인지를 판단하는 것이 어렵지만 예를 들어 polyenen계 항생물질은 UV 스펙트럼 등으로 간단히 구별되기도 합니다. 또한 대부분의 경우 이 단계에서 활성물질의 물리 화학적 특성이 완전히 밝혀지기는 어렵지만 예비 추출 시험에 근거하여 어느 정도 물리 화학적 성질을 추정하고 이를 고려하여 소량의 활성물질을 분리한 후 신규물질 또는 기지 물질 여부를 판단하게 됩니다.

 

이들을 효과적으로 screening하기 위해서는 종래부터 paper chromatography, UV spectrum 또는 각종 정색 반응 등 여러 가지 방법이 널리 이용되어 왔으나 특히 TLC(Thin Layer Chromatography) 방법이 screening 초기 단계에는 유력한 수단이 됩니다. 이 방법에 의하면 신속성, 고도의 분리 능력 등으로 인하여 활성물질의 분리, 정제 및 동정에 필요한 양을 간단히 얻을 수 있기 때문입니다.

 

활성물질을 분리 정제해 나가는데는 정해진 방법이 확립될 수 없기에 풍부한 경험과 이론이 요구됩니다. 신속하고 효과적인 분리정제를 위해서 여러 종류의 resin, 활성물질, 용매들의 성질과 이들과의 상호관계를 알기 위해서 유기화학적 지식, 크로마토그래피 이론과 정제 된 물질의 구조 규명을 위해  NMR, IR, UV, MS 등을 이용한 기기분석 관련 지식을 기본적으로 습득해야 합니다.

 

우선 1차적으로 활성이 있는 것이 확인되면 활성 물질의 각종 특성을 파악하는 데 필요한 시료 획득을 위해 분리, 정제를 행하며 그 전에 미리 예비 추출 실험을 하여야 한다. 즉 활성물질이 안정한 지, 불안정한 물질인지, 어떤 유기용매에 추출이 가능한지, 어떠한 resin에 흡착이 될 수 있는지 등을 조사합니다. 이를 위해서 각 실험 별로 2~10ml 정도에 해당하는 소량의 배양액을 사용하여 실험하게 되는 이러한 예비실험을 통하여 목적으로 하는 물질의 성질을 어느 정도 파악하게 됩니다.

 

1) 균체 추출실험

균 배양액을 여과 또는 원심 분리하여 배양 상등액과 균체로 분리합니다 균체 부분에는 80% acetine을 첨가하여 교반 하거나 하룻밤 침적시킨 후 여과하여 acetone 추출액을 얻고 배양 상등액과 같은 양으로 균체 추출액을 조정한 후 각 부분의 활성을 검정하여 활성물질의 분포도를 조사하는 방법입니다.

 

2) pH 및 열 안정성 시험

pH 및 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 각 실험 당 2~3ml 정도씩의 배양 여액을 사용합니다. 먼저 배양액의 pH를 2,7,10으로 각각 조정하여 적당한 가열 조건, 예를 들면 100도의 비등액 중에서 15분간 가열한 후 냉각시킵니다. 그리고 배양액의 pH를 중성으로 조정하여 활성을 검정하고 활성이 감소된 정도를 조사합니다.

 

3) 유기용매에 대한 분배성

소량의 배양액과 물과 혼합되지 않는 유기용매를 사용하여 두 층에 대한 활성물질의 분배성을 조사합니다. 유기용매로서는 친수성기를 가진 물질은 추출되기 어려운 것과 넓은 범위의 물질을 추출할 수 있는 것 등 2종류를 동시에 사용하여 분배 실험을 행하고 그 결과를 비교합니다. 유기용매로서 chloroform을 사용하기도 하지만 일반적으로 극성이 낮은 ethylacetate와 극성이 높은 butanol을 많이 사용합니다.

 

4) 흡착제에 대한 흡착성

흡착제로서 활성탄 또는 합성 흡착제를 사용하여 활성물질의 흡착, 탈착 성을 조사합니다. 왜냐하면 배양액으로부터 1차적인 물질의 분리, 정제방법으로 합성 흡착제 등 흡착제의 사용이 가능하다면 온화한 조건하에서 효율성 높게 목적하는 물질을 분리할 수 있고 또한 분리, 정제 시에 필요한 탈염 조작에 이용할 수 있기 때문입니다.

 

5) 이온 교환수지에 대한 흡착성

배양 여액을 양이온 교환수지, 음이온 교환수지에 통과시켜 이온 교환수지에 대한 활성 물질을 흡착성과 탈착 성을 조사합니다. 그 결과에 따라 수용성 물질인 경우에는 명확히 산성, 염기성, 양성, 중성으로 판단할 수 있으나 지용성 물질 또는 불안정한 물질인 경우에는 용해성, 이온화, 불안정성 등으로 인하여 정확한 판단이 어려운 경우도 많습니다.